Creating Biomedical Technologies to Improve Health

Construyendo un Ovario Artificial – Una Nueva Herramienta para Entender la Biología Reproductiva y Preservar la Fertilidad

Wednesday, September 30, 2009

El hidrogel sirve para mantener la arquitectura del folículo. En un cultivo 2D, el folículo se aplana, y las células granulosa y teca se separan y emigran del ovocito en la superficie de poliestireno, eliminando la comunicación entre las células foliculares. En 3D, el folículo mantiene su arquitectura normal, permitiendo así la comunicación entre células. Verde: filamentos de actina (citoesqueleto). Rojo: rodamina-dextrano, un factor soluble internalizado por células que reflejan la actividad diferencial dentro de la población celular. Ooc – ovocito.

The hydrogel serves to maintain the architecture of the follicle. In 2D culture, the follicle flattens, and the granulosa and theca cells dissociate and migrate from the oocyte on the polystyrene surface, abolishing communication between follicular cells. In 3D, the follicle maintains its normal architecture, thereby allowing for communication between cells. Green: actin filaments (cytoskeleton). Red: rhodamine-dextran, a soluble factor internalized by cells that reflects differential activity within the cell population. Ooc – oocyte.

Los efectos tóxicos de la quimioterapia y/o radiación dejan a muchos sobrevivientes jóvenes de cáncer incapaces de tener hijos más tarde en su vida. Algunas mujeres eligen someterse a fertilización in vitro (FIV) y congelar los embriones antes de comenzar la quimioterapia. Esta no es una opción para mujeres y niñas que no tienen una pareja permanente, o para aquellas que tienen un tipo de cáncer agresivo que requiere de terapia inmediata, ya que la FIV requiere de tratamientos hormonales prolongados para producir óvulos (ovocitos) en los ovarios, así como de disponibilidad de esperma donado. En dichos casos, la única posibilidad de preservar la fertilidad a largo plazo es removiendo y congelando los ovarios o pedazos del tejido del ovario. Después de que un paciente está libre de cáncer y listo para empezar una familia, se le puede transplantar el tejido almacenado de sus ovarios, pero existe el riesgo de reintroducir células malignas. Para evitar este riesgo, se pueden cultivar en laboratorio los folículos que contengan ovocitos inmaduros mediante un proceso de maduración llamado in follicle maturation (IFM). Los folículos son unidades útiles dentro de un ovario que contienen un ovocito individual rodeado de células de soporte llamadas células teca y células granulosa. En el IFM, los folículos se cultivan y maduran hasta la etapa en que los ovocitos pueden ser liberados de los folículos (como ocurre naturalmente durante la ovulación) y se fertilizan in vitro para la implantación subsecuente para producir vástagos.

 

Matriz 3D Soporta la Maduración Folicular in Vitro

Folículos son aislados y encapsulados con alginato, el cual mantiene la arquitectura 3D. Los folículos empiezan en un estado inmaduro y desarrollan una cavidad antral. En un modelo de ratón, lo ovocitos recuperados al final del cultivo se pueden fertilizar, y la transferencia de embriones puede resultar en nacimientos con vida. A: folículos aislados; B: folículo en alginato en día 0; C: fotografía de cerca de un folículo en día 0; D: folículo después de 8 días de cultivo; E: folículo seccionado al final del cultivo; F: nacimientos con vida de folículos cultivados.

Follicles are isolated and encapsulated within alginate, which maintains the 3D architecture. The follicles begin in an immature state and develop an antral cavity. In a mouse model, oocytes retrieved at the end of culture can be fertilized, and the transfer of embryos can result in live births. A: isolated follicles; B: follicle in alginate at day 0; C: close-up of follicle at day 0; D: follicle after 8 days culture; E: sectioned follicle at end of culture; F: live births from cultured follicles.

La maduración folicular es regulada por factores de crecimiento y hormonas liberadas por los ovarios y la glándula pituitaria, así como por señales del tejido que rodea al folículo y por la comunicación entre el ovocito y las células que lo soportan. En los sistemas tradicionales de cultivo de células donde los folículos crecen fijos a una superficie 2D, la conectividad entre las células de apoyo teca y granulosa y el ovocito se perturba, llevando a la alteración de señales que dirigen el desarrollo de ovocitos.

Para enfrentar este reto, Lonnie Shea, Profesor de Ingeniería Química y Biológica en la Universidad de Northwestern, y Teresa Woodruff, Profesora Thomas J. Watkins de Obstetricia y Ginecología, y Profesora de Bioquímica, Biología Molecular y Biología Celular en la Universidad de Northwestern, han colaborado en el desarrollo de sistemas de cultivo 3D para la maduración de folículos frescos y congelados. Los sistemas 3D están basados en una plataforma de hidrogel con alginato para imitar el ambiente del ovario nativo. El hidrogel mantiene la arquitectura del folículo y las interacciones entre las células foliculares. Los folículos individuales pueden madurarse in vitro con la adición de factores de crecimiento y hormonas.

A pesar de que los folículos son unidades independientes, la ausencia de células estromales en el sistema de cultivo podría alterar el proceso normal de desarrollo folicular. Por ejemplo, el equipo de investigación de Shea y Woodruff descubrió que los niveles de expresión de diversos genes eran diferentes in vivo que in vitro, incluyendo un gen para una proteína que regula la acumulación de líquido en el folículo – un proceso que afecta el tamaño del folículo. Esto podría explicar por qué los folículos crecidos in vitro son más pequeños que in vivo. La expresión diferencial de genes en folículos frescos y congelados tal vez sea causada por el daño causado mediante el proceso de congelamiento. “Existen dos retos principales en la congelación de tejido – la penetración de crioprotectores por todo el tejido en la concentración apropiada para cada tipo de célula, y el mantener la organización y conexión de células dentro del tejido durante la congelación y deshielo”, explica Shea. El congelamiento rápido (vitrificación) está surgiendo como una alternativa prometedora de retardar la congelación ya que elimina el riesgo de que se formen cristales de hielo, lo cual puede dañar las células.

 

Entendiendo la Enfermedad Folicular y la Infertilidad Asociada con la Edad

Para mejorar aún más en el sistema 3D, Shea examinó cómo las diferentes composiciones de hydorgeles afectan la maduración folicular. Notó que la rigidez del hidrogel tenía un impacto en el tamaño del folículo, en la producción de hormonas esteroides, y en la calidad de los ovocitos. Numerosos genes fueron expresados diferencialmente en hidrogeles más rígidos contra menos rígidos. “Empezamos a ver que los folículos no se desarrollaban de la misma manera en un gel rígido. Por ejemplo, los niveles de esteroides difieren cuando el gel se va haciendo más rígido”, dice Shea. Curiosamente, un problema similar con la regulación de hormonas esteroides ocurre en mujeres con Síndrome de Ovario Poliquístico (SOPQ), un desorden metabólico que afecta a una de cada 10 mujeres americanas y es una causa común de infertilidad. Este hallazgo sugiere que los mecanismos del ovario podrían ser diferentes en pacientes con SOPQ en relación a mujeres saludables.

Otra causa común de infertilidad es la edad maternal avanzada, ya que muchas parejas posponen el comenzar una familia. “Este sistema in vitro nos permite investigar los mecanismos moleculares fundamentales de la salud folicular, la calidad del óvulo, la aneuploidía (cambios en el número de cromosomas), y muchas de las consecuencias naturales del envejecimiento que vemos en el humano pero que no logramos descifrar. Aún no se conocen cuales son las contribuciones del óvulo y de las células granulosas relativas a la infertilidad asociada con la edad”, explica Teresa Woodruff.

 

El Consorcio de Oncofertilidad

Para facilitar la traducción de tecnologías IFM hacia la clínica, Woodruff inició el Consorcio de Oncofertilidad, un programa que ofrece una variedad de cuidadosos enfoques para la administración de fertilidad en personas jóvenes con cáncer. “El programa incluye expertos en ética, humanistas, responsables de política, economistas, y gente interesada en la comunicación y la educación. Ofrece oportunidad translacional de tomar métodos que han sido desarrollados en el ratón y probarlos en el mono, y adaptarlos del mono a los humanos”, explica Woodruff. Añade que “el entorno del ovario y la rigidez mecánica del tejido difieren entre las especies animales. Una razón por la que hemos sido capaces de adaptar el sistema a través de diferentes plataformas animales es que tenemos una solución biomaterial adaptada para la maduración folicular [p. ej. varias plataformas 3D de hidrogel con alginato que soportan folículos de diferentes especies]”. Los colaboradores de Shea en el Centro Nacional de Primates en Oregon están traduciendo ya el sistema de cultivo hacia los primates. La investigación de Shea usa tejido humano donado por pacientes de cáncer que eligen tener sus ovarios congelados en Northwestern.

 

Futuros Rumbos

El sistema de cultivo 3D ha dado nuevas ideas para opciones de preservación de fertilidad. Sirve además como modelo para entender los principios biológicos fundamentales, el desarrollo folicular en diversas especies, el deterioro de la calidad folicular relacionado con la edad, y la base molecular de enfermedades foliculares. “Yo pienso que finalmente esa es la fuerza real de lo que hemos sido capaces de hacer”, dice Shea. Su equipo de investigación está trabajando en la siguiente generación de biomateriales, utilizando una nueva formulación del hidrogel. El entorno sintético del sistema de cultivo 3D, combinado con técnicas de imágenes y análisis bioquímico, permitirá a los investigadores monitorear los eventos moleculares y celulares durante el desarrollo folicular.

Este trabajo está apoyado en parte por el Instituto Nacional de Bioingeniería e Imágenes Biomédicas y el Roadmap del NIH para Investigación Médica.

 

Referencias

Xu M, Banc A, Woodruff TK, Shea LD. Secondary follicle growth and oocyte maturation by culture in alginate hydrogel following cryopreservation of the ovary or individual follicles. Biotechnol Bioeng. 2009 June 1;103(2):378-86.

West-Farrell ER, Xu M, Gomberg MA, Chow YH, Woodruff TK, Shea LD. The mouse follicle microenvironment regulates antrum formation and steroid production: alterations in gene expression profiles. Biol Reprod. 2009 March;80(3):432-9. Epub 2008 Nov 12.

El Consorcio de Oncofertilidad (http://oncofertility.northwestern.edu/)