Creating Biomedical Technologies to Improve Health

Vacunas Contra Enfermedades Infecciosas Mejoran con el Programa de Imágenes

Wednesday, June 6, 2007

Los pili son largos complejos de filamentos de proteína en la superficie de la célula bacteriana. Muchos de ellos son importantes para que las bacterias se adhieran a las células humanas, un paso esencial en el proceso de la infección bacteriana. El método IHRSR se ha utilizado para reconstruir los pili de la bacteria responsable de la gonorrea, enfermedad transmitida sexualmente. Las cintas magenta corresponden a la estructura cristalina de una sub-unidad proteínica determinada mediante rayos X y superpuesta en la reconstrucción tridimensional (superficie gris). Imagen cortesía de Edward H. Egelman.

Los pili son largos complejos de filamentos de proteína en la superficie de la célula bacteriana. Muchos de ellos son importantes para que las bacterias se adhieran a las células humanas, un paso esencial en el proceso de la infección bacteriana. El método IHRSR se ha utilizado para reconstruir los pili de la bacteria responsable de la gonorrea, enfermedad transmitida sexualmente. Las cintas magenta corresponden a la estructura cristalina de una sub-unidad proteínica determinada mediante rayos X y superpuesta en la reconstrucción tridimensional (superficie gris). Imagen cortesía de Edward H. Egelman.

Según los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC por sus siglas en inglés), más de 700,000 personas en los Estados Unidos se infectan cada año de gonorrea, una enfermedad transmitida sexualmente. Otros 10 millones de viajeros internacionales sufren anualmente los desagradables síntomas de la diarrea del viajero. A pesar de que estas enfermedades son causadas por distintas bacterias, éstas tienen algo en común. Ambos tipos poseen pequeños filamentos como cabellos, o pili, que se adhieren y fijan las bacterias dentro del cuerpo.

Debido a su forma irregular, no es fácil poder observar con detalle estos largos y delgados filamentos. Sin embargo, Edward Egelman, investigador de la Universidad de Virginia, desarrolló una manera de ver los filamentos en tres dimensiones. Este nuevo método de imágenes ayudará a los investigadores a desarrollar vacunas y medicamentos mejorados para prevenir el brote de enfermedades altamente contagiosas como la gonorrea y la diarrea del viajero.

Estructura de los Pili Revelada

Una de las grandes preguntas acerca de los pili en las bacterias de gonorrea se refiere a la habilidad de estas bacterias para cambiar continuamente los amino ácidos de los pili para evitar la respuesta inmune del cuerpo. Al cambiar la secuencia de amino ácidos, las bacterias nunca se eliminan por completo y su presencia continua puede resultar en infecciones repetitivas, que podrían a su vez causar infertilidad, artritis, y meningitis.

Para determinar cómo las bacterias alteran los pili, Egelman y un grupo de investigadores de la Universidad Simon Fraser, del Instituto Burnham, y del Instituto Scripps de Investigación, tomaron imágenes bidimensionales de los pili con un microscopio electrónico. Después cargaron la información de dichas imágenes en el programa nuevo de Egelman para análisis de imágenes – el Método Iterativo de Reconstrucción del Espacio Real de las Hélices (IHRSR por sus siglas en inglés).

El programa de cómputo resuelve una serie de ecuaciones matemáticas basadas en una suposición inicial de la posible estructura de los pili. Esta suposición “se basa en un conocimiento previo del número de sub-unidades por longitud en el filamento”, dice Egelman, profesor del Departamento de Bioquímica y Genética Molecular en la Universidad de Virginia. Mientras la computadora va resolviendo las ecuaciones, va también probando diferentes simetrías semejantes a una cinta para ver cual encaja mejor con la información original de las micrografías electrónicas. Este procedimiento conlleva a la estructura tridimensional del filamento bajo estudio.

Basándose en reconstrucciones tridimensionales de los pili de gonorrea, Egelman y sus colegas desarrollaron una estructura molecular detallada de los pili; esta estructura ofrece una base para desarrollar vacunas contra los pili. Además, hendiduras encontradas en la superficie de los pili podrían servir de blancos para ciertas drogas diseñadas especialmente para bloquear patógenos.

Beneficios del Método IHRSR

El grupo de investigadores escogió el método IHRSR porque es más eficiente que otros métodos en la reconstrucción de polímeros de hélices de alta variación (la clase de grandes complejos a los que pertenecen los pili). “Métodos anteriores para reconstrucción de imágenes requieren filamentos sumamente ordenados, pero la mayoría de los filamentos [como los pili] no están ordenados”, explica Egelman. El programa permite también estudiar las variaciones entre filamentos, en lugar de estudiar solamente la estructura promedio de todos ellos, como era el caso en los programas anteriores.

La generación de reconstrucciones tridimensionales requiere de computadoras muy rápidas. “El método que hemos usado para reconstruir las hélices no hubiera sido posible en 1968 [cuando se generó la primera reconstrucción tridimensional usando microscopía electrónica], ni siquiera aún en 1988. De hecho, hay cosas que podemos hacer ahora que no se podían haber hecho fácilmente hace sólo 5 años”, dice Egelman. Los programas de reconstrucción funcionan en computadoras construidas por miembros del laboratorio de Egelman.

Pili con filamentos de tipo IV controlan el movimiento, adherencia, escape inmune, y transformación natural de bacterias patógenas Gram negativas. Los pili son blancos atractivos para las vacunas y la medicina terapéutica debido al papel importante que juegan en la virulencia bacteriana y también por su amplia exposición en la superficie de la célula, como se muestra en esta electromicrografía de barrido de diplococos de Neisseria gonorrhoeae (fondo cortesía de Charles Brinton). Imagen cortesía de Edward H. Egelman.

Pili con filamentos de tipo IV controlan el movimiento, adherencia, escape inmune, y transformación natural de bacterias patógenas Gram negativas. Los pili son blancos atractivos para las vacunas y la medicina terapéutica debido al papel importante que juegan en la virulencia bacteriana y también por su amplia exposición en la superficie de la célula, como se muestra en esta electromicrografía de barrido de diplococos de Neisseria gonorrhoeae (fondo cortesía de Charles Brinton). Imagen cortesía de Edward H. Egelman.

Averiguando la Causa de la Diarrea del Viajero

Esther Bullitt, colega de Egelman y profesora asociada en el Departamento de Fisiología y Biofísica de la Escuela de Medicina en la Universidad de Boston, ha utilizado la técnica del IHRSR para estudiar la estructura de la bacteria enterotoxigénica E. coli (ETEC por sus siglas en inglés), una de las principales causas de la diarrea del viajero y también de diarrea bacteriana en niños que viven en países subdesarrollados.

Las bacterias ETEC se adhieren a la pared intestinal utilizando los pili. Una vez adheridas, las bacterias se multiplican y producen toxinas que estimulan un torrente de fluidos intestinales, provocando diarrea que puede resultar en deshidratación. El trabajo de Bullitt en estructura bacteriana ha ayudado a Stephen Savarino, en el Centro Naval de Investigación Médica, a desarrollar una vacuna que se espera pueda bloquear tanto la adherencia de las bacterias como la actividad de las toxinas. La meta de Savarino es interrumpir la infección en su etapa inicial, para reducir el número de casos y la severidad de la diarrea causada por bacterias ETEC.

Antes de usar el método IHRSR de Egelman, Bullitt utilizó métodos de reconstrucción que le exigían conocer la simetría exacta de las hélices del filamento que estaba estudiando. “Cuando la hélice es perfecta, se puede calcular la simetría, pero en la mayoría de los casos no lo es”, explica Bullitt. En realidad, para Bullitt fue muy difícil poder obtener imágenes bidimensionales claras de los filamentos, debido a que eran muy pequeños. “Durante 2 años traté de determinar la simetría de las hélices pero nunca tuve la certeza de que era la correcta”, dice ella.

En una reunión de una “sección de estudio” de NIH, Bullitt escuchó a Egelman describir su nuevo método a un colega y preguntó si podía probarlo. Egelman aceptó y, en colaboración con Bullitt, expandió el programa de manera que pudiera ser aplicado a una mayor variedad de muestras.

“Este método ayuda a los investigadores a determinar con mayor precisión la estructura de los filamentos y a crear con mayor eficiencia un volumen de conocimiento suficientemente grande para tratar bacterias que causan enfermedades”, dice Bullitt. Añade además que el método de Egelman no requiere que los investigadores posean conocimientos profundos de las estructuras de las hélices. “No necesitas ser un experto, por lo que llegas más rápido al significado de la respuesta en vez de batallar con obtenerla”, dice ella.

Direcciones a Futuro

Egelman continuará refinando la técnica IHSRS a través de su trabajo en diferentes sistemas relacionados con bacterias causantes de enfermedades, así como los relacionados con el movimiento y la acción muscular. Egelman espera poder diseminar el programa, actualmente utilizado en un par de docenas de laboratorios en el mundo, simplificando su uso. Mejoras adicionales incluirán una mejor resolución de imagen y un programa nuevo para alinear imágenes y refinar las estructuras tridimensionales. “Esta será la manera principal de ver las estructuras de las hélices en 10 años”, dice Bullitt.

Este trabajo está apoyado en parte por el Instituto Nacional de Bioingeniería e Imágenes Biomédicas (NIBIB por sus siglas en inglés), el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (NIGMS), y el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID).

Referencias

Egelman EH. The iterative helical real space reconstruction method: Surmounting the problems posed by real polymers. J Struct Biol 157(1): 83-94; 2007.

Craig L, Volkmann N, Arvai AS, Pique ME, Yeager M, Egelman EH, Tainer JA. Type IV pilus structure by cryo-electron microscopy and crystallography: Implications for pilus assembly and functions. Mol Cell 23(5): 651-662; 2006.

Poole ST, McVeigh AL, Anantha RP, Lee LH, Akay YM, Pontzer EA, Scott DA, Bullit E, Saravino SJ. Donor strand complementation governs intersubunit interaction of fimbriae of the alternate chaperone pathway. Mol Microbiol 63(5): 1372-1384; 2007.

Edward H. Egelmen