Creating Biomedical Technologies to Improve Health

¿Qué Hay en una Huella? Una Nueva Manera de Sondear la Estructura de las Proteínas de Membrana

Friday, April 29, 2011

Cuando el canal de potasio cambia del estado cerrado al abierto, amino ácidos específicos cambian de posición y se hacen accesibles al etiquetado radiolítico. Los diferentes colores en este esquema de un canal de potasio bacterial indican el grado de etiquetado radiolítico; el color azul indica la menor cantidad de radicales hidroxilos, y el rojo indica el máximo de radicales hidroxilos. Las partes con un mayor grado de etiquetado (rojo) se mueven más cuando el canal se abre.

As the potassium channel transitions from closed to open state, specific amino acids shift position and become accessible to radiolytic labeling. Different colors in this schematic of a bacterial potassium channel indicate the extent of radiolytic labeling; blue indicates the fewest hydroxyl radicals, and red indicates the most hydroxyl radicals. The parts with a higher degree of labeling (red) move the most as the channel opens.

Alrededor de la mitad de todas las proteínas residen en la membrana celular, transmitiendo mensajes de un lado de la membrana al otro. Las proteínas de membrana llamadas canales de potasio controlan una variedad de procesos como la comunicación de las células nerviosas, la secreción de las hormonas, y el ritmo cardíaco. Los canales de potasio son esencialmente los poros en la membrana celular a través de los cuales fluyen los iones de potasio, estableciendo un potencial eléctrico a lo largo de la membrana. El flujo de iones de potasio es necesario para la conducción de los impulsos nerviosos y la contracción del músculo cardíaco. La función anormal del canal de potasio se ha relacionado con enfermedades del corazón, los riñones, el páncreas, y el sistema nervioso central. Se cree que una "compuerta" controla la apertura y cierre del canal de potasio en respuesta a diferentes estímulos. Los cambios en la forma de la boca interior del canal probablemente cambian la compuerta a una posición abierta; debido a que los científicos no entienden cómo se ve el canal en la posición abierta comparado con su contraparte cerrada, no han sido capaces de entender completamente cómo funciona este proceso.

 

Irradiando una Instantánea de una Proteína

Una novedosa metodología iniciada por Mark Chance, director del Centro de Proteómica y Bioinformática en la Universidad de Case Western Reserve, promete proporcionar respuestas sobre la interacción dinámica entre la estructura y la función de las proteínas de membrana. El enfoque, conocido como huella peptídica, combina el etiquetado radiolítico con la espectrometría de masas estructural. En el etiquetado radiolítico, se irradian muestras de proteína con rayos X de alto flujo durante un período de tiempo muy corto – una milésima de segundo. La radiación descompone las moléculas de agua y las convierte en radicales hidroxilos, que rápidamente se unen a las zonas de la proteína que están expuestas al agua (por ejemplo, aquellas cercanas a la superficie del canal). Durante la apertura y cierre, la proteína cambia de forma, exponiendo las diferentes áreas de la proteína al agua. Así, es más probable que las diferentes áreas de la proteína sean etiquetadas con radicales hidroxilos cuando el canal de potasio se encuentra en el estado abierto que cuando está cerrado. Para identificar los aminoácidos (los componentes básicos de las proteínas) que cambian de posición durante la apertura y cierre, los investigadores marcaron los canales en los estados abiertos y cerrados y luego analizaron las dos muestras usando espectrometría de masas.

 

El Sistema de Compuertas de un Canal

 

Datos de huellas peptídicas en los estados abiertos y cerrados sugieren que hay tres puertas que controlan el flujo de iones de potasio (mostrados aquí como puntos rojos) a través del canal. Las áreas del canal que cambian más entre los dos estados están marcadas en rojo. La banda sombreada en verde representa la membrana celular, con el interior de la célula mostrado debajo de la membrana. (Reimpreso de Gupta S, Bavro VN, D'Mello R, et al. Conformational changes during the gating of a potassium channel revealed by structural mass spectrometry. Structure. 2010 Jul 14;18(7):839-46, con permiso de Elsevier).

Protein footprinting data on the open and closed states suggest that three gates control the flow of potassium ions (shown here as red dots) through the channel. The areas of the channel that shift the most between the two states are circled in red. The green-shaded band represents the cell membrane, with the cell interior shown below the membrane. (Reprinted from Gupta S, Bavro VN, D'Mello R, et al. Conformational changes during the gating of a potassium channel revealed by structural mass spectrometry. Structure. 2010 Jul 14;18(7):839-46, with permission from Elsevier).

Observando las diferencias entre los estados abiertos y cerrados le permitió a Chance y a colaboradores de la Universidad de Oxford determinar con precisión cuales aminoácidos son esenciales en la mediación del flujo de iones a través del canal y su sistema de compuertas. "Nuestra información sobre el estado abierto del canal puede ayudar a diseñar experimentos en un contexto electrofisiológico [la medida del cambio de voltaje o corriente eléctrica en los canales iónicos y las células], el diseño de ciertos fármacos, o hacer ciertas mutaciones para sondear la estructura y función", dice Chance. Sus resultados complementan datos anteriores de la estructura del canal en el estado cerrado y las primeras predicciones teóricas del sistema de compuertas de los canales de potasio. Esclarecer el proceso de compuertas es fundamental para la comprensión de cómo las moléculas de señalización regulan el sistema de compuertas y cómo las mutaciones heredadas y los fármacos afectan la función de los canales de potasio. Este conocimiento podría resultar en avances para la medicina cardiovascular.

Con las metodologías actuales, es muy difícil estudiar la estructura de los canales de potasio humanos en una membrana celular. Por lo tanto, Chance realizó sus experimentos en un detergente que imita el entorno natural de la membrana. "Nos gustaría llegar a un punto donde podamos hacer experimentos más elegantes con la tecnología de huella peptídica, ya sea en la membrana o en la célula", comenta él. Los investigadores no pueden estar seguros de que la estructura observada en el detergente es la misma que se encontraría en una célula.

 

Revelando Aguas Estructurales y las Acciones de los Fármacos

Para una clase de proteínas llamadas receptores acoplados a proteínas G (GPCR por sus siglas en inglés), muy pronto será posible obtener "huellas" de la estructura de las proteínas directamente en las células y tejidos nativos. Trabajando con Krzysztof Palczewski, presidente del departamento de farmacología en la Universidad de Case Western Reserve, Chance recientemente descubrió moléculas de agua en el centro de la región que abarca la membrana de la rodopsina, un GPCR involucrado en la visión. Además de la estabilización de la estructura de la proteína, parece que estas moléculas de agua ayudan a cambiar la forma de la rodopsina cuando esta se expone a la luz.

"Es como si estar engrasando la proteína de modo que ahora puede cambiar la conformación [forma] dependiente del entorno", dice Palczewski. Él cree que la presencia de estas moléculas de agua "estructurales" es común entre las proteínas de membranas. Juntos, Chance y Palczewski, ya han descubierto moléculas de agua escondidas en varios otros GPCRs, así como dentro de un canal de potasio. "El agua es una parte muy importante de la proteína de membrana, lo que no podemos simplemente ignorar", dice Palczewski.

Obtener huellas de proteína ofrece una oportunidad única de ver cómo funcionan los canales y receptores en tiempo real, y la técnica es actualmente la única forma directa para estudiar cómo funcionan las moléculas de agua dentro de las proteínas. Aunque casi la mitad de los fármacos se enfocan a los GPCRs, se desconoce en gran parte cómo estos fármacos afectan los cambios en la forma de las proteínas, ya sea en los canales iónicos o GPCRs. "Hemos desarrollado estas tecnologías específicamente porque existe actualmente una barrera en la comprensión. [La investigación] está realmente evolucionando muy rápidamente; es muy emocionante en este momento", dice Chance. Los nuevos conocimientos derivados de esta tecnología ayudarán a los investigadores a diseñar fármacos más eficaces para las enfermedades que involucran proteínas de membranas.

Este trabajo está apoyado en parte por el Instituto Nacional de Bioingeniería e Imágenes Biomédicas y por el Departamento de Energía de los Estados Unidos.

 


Gupta S, Bavro VN, D'Mello R, Tucker SJ, Vénien-Bryan C, Chance MR. Conformational changes during the gating of a potassium channel revealed by structural mass spectrometry. Structure. 2010 Jul 14;18(7):839-46.

Angel TE, Gupta S, Jastrzebska B, Palczewski K, Chance MR. Structural waters define a functional channel mediating activation of the GPCR, rhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Aug 25;106(34):14367-72.

http://www.case.edu/medicus/magazine/winter2011/discoveries/proteomics-and-cardiology.html